南京失守后，国民党的军政领导机关大部分迁移武汉。武汉是中国内地水陆交通枢纽，成为当时抗战的军事、政治、经济中心。此时陈诚担任武汉卫戍总司令部总司令、第九战区司令长官，负责武汉保卫战的指挥工作。他还担任军事委员会政治部主任，与文化界人士及中共代表合作，一定程度上推动了抗战文化的发展。在军事上，他认为南京弃守后，武汉即是敌人势在必取的唯一目标。保卫武汉战略要点，应以三镇为核心，使其灵活运用，发挥抗战的最大力量。按军政合一原则，陈诚还兼任湖北省政府主席之职。

    1938年7月22日夜，日军波田支队从鄱阳湖滨的姑塘登陆，继而侵占九江。紧接着以5个师团分左右两路，夹大江两岸向西展开猛烈攻势。陈诚第九战区与李宗仁第五战区分守南北二路，第九战区负责对付鄱阳湖沿岸及田家镇要塞以东地区来犯之敌。所辖薛岳第一兵团25个师在南昌至德安附近鄱阳湖沿岸一线组织防御，阻敌西进；张发奎第二兵团40个师在九江以西至幕阜山、九宫山一线组织防御，阻敌沿长江进攻武汉。陈诚令李汉魂的第二十九军团撤至庐山两侧及南浔路一带，依托有利地形，与向南昌进攻的敌左路军相持一个月之久。在薛岳指挥下，取得重创日军第106师团的万家岭大捷。8月10日，第二兵团的第三军团，在瑞昌东北一线与登陆的右路日军波田支队激战两星期。后来，日军以主力第9、第27师团，在数十架飞机掩护下，分三路合击瑞昌，并施放毒气，致第三军团伤亡惨重。经过四个月的节节抵抗后，陈诚奉蒋介石命令，按预定计划，于10月25日将部队全部撤出武汉，退至江西、湖南两省的永修、幕阜山、岳阳以南一线。

    武汉沦陷后，陈诚将九战区军事交由薛岳代理，自己赴渝请训。

    1939年9月，日军以赣北、鄂南两路策应湘北主力军，会攻长沙。陈诚奉命和副总长白崇禧抵湘，协助薛岳代长官指挥作战。出发前，他曾提出长沙“守”与“不守”两条，奉批“不守”。因此，一到达渌口，就将蒋介石的旨意转告给薛岳。

    薛不以为然，说：“长沙不守，军人之职责何在？”虽一夜之间，九次电话命薛退出长沙，而薛不听。陈诚怕彼此争论过久有碍戎机，在向薛询问部队的情况后，乃一面与白商定，命薛岳反攻；一面将薛之决心及当时情况报告蒋介石。结果，取得了湘北抗战的第一次胜利。

    陈诚在抗战中，转战八年，悉心指挥，为打击日本侵略者、夺取抗日战争的胜利，作出了贡献。

    陈诚在主持军政工作中，向以雷厉风行的作风而闻名。他处理问题坚决果断，不徇私情，不留情面。抗战中陈诚主政湖北，在军务倥偬中偶尔问政，竟断了几个“大案”。监利县长黄向荣，用公款做棉花生意，被省参议员傅鹤琴向陈诚作了检举。陈诚立即将黄逮捕法办。省保安司令部的人与黄的关系较好，又同情其乃初犯，所以延迟半年，迟迟未办。1943年陈诚调任远征军司令长官，动身前夕，省保安司令部将拟判黄十二年徒刑的判决书，匆匆送陈审阅，意欲保黄过关，免其一死。不料陈诚阅后，勃然大怒，拍着桌子连骂几声“混蛋”，在签呈上赫然批了四个大字：“即予枪决”。原想成全黄的一纸签呈，反成了送黄入地的催命书。黄在临刑前，抽出钢笔给妻子写下四句遗言：“杀我吓人，死不甘心，教我子孙，再莫做官。”写完后，也骂了几声“混蛋”。对黄的处置是否过重，人们说法不一。但陈诚此举有一定震慑作用，确是不可置疑的。宜昌县长武长青，在颁发鸦片烟膏新旧牌照的交替期间，经过请示行政督察专员吴良琛，同意商人们的捐赠达一定数额款项的前提下，可先无照营业。这种捐赠的款项，既有利于缓解县财政的困难，又可使县长本人得到好处。有人把这件事告到陈诚那里，正逢陈诚召开县长会议。陈诚令将武长青解押恩施（当时省会设恩施）。县长们拭目以待，他们知道武长青和陈诚有同学之谊。到了会议结束的一天，陈诚下令：“宜昌县长武长青贪污有罪，着即枪毙。”主办法官踌躇良久，鼓足勇气向陈诚直言：“武长青的案件还没有审讯，可否等审问清楚了再枪决？”陈诚大怒，吼道：“什么审讯不审讯，马上枪决，不准迟疑。”据说武长青临刑前，大呼冤枉。

    曾经同意武长青接受捐款的行政督察专员吴良琛，吓得魂不附体，跑到测字摊上去算命，求问吉凶。